Pesquisadores do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) desenvolveram, por meio de técnicas de engenharia genética, um fungo capaz de produzir um coquetel de enzimas que degrada a biomassa. Por esse processo, as enzimas atuam de forma coordenada na quebra e conversão de carboidratos da palha e do bagaço da cana-de-açúcar em açúcares simples, que podem sofrer fermentação e, assim, se transformar em biocombustível.

A descoberta abre caminho para maior aproveitamento dos resíduos da cana-de-açúcar na fabricação de biocombustíveis, uma vez que o desenvolvimento de um coquetel de enzimas de baixo custo representa um dos principais desafios para a produção do etanol de segunda geração (derivado do bagaço e da palha da cana-de-açúcar).

Para que o fungo pudesse servir como uma biofábrica altamente produtiva do coquetel enzimático, os pesquisadores do CNPEM realizaram seis modificações genéticas em uma cepa já conhecida do Trichoderma reesei, a RUT-C30. O trabalho foi patenteado e teve artigo publicado na revista Biotechnology for Biofuels.

“O fungo foi racionalmente modificado de forma que ele maximizasse a produção das enzimas de interesse biotecnológico. Por meio de técnica de edição genética conhecida como CRISPR/Cas9, alteramos fatores de transcrição para regular a expressão de genes relacionados às enzimas, deletamos proteases que causavam problemas na estabilidade do coquetel enzimático e também adicionamos enzimas importantes que eram naturalmente deficientes no fungo. Com isso, foi possível fazer com que ele produzisse uma quantidade grande de enzimas a partir de uma fonte nutricional barata como resíduos agroindustriais abundantes no Brasil”, explica Mário Murakami, diretor científico do Laboratório Nacional de Biorrenováveis (LNBR-CNPEM), à Agência FAPESP.

Segundo dados da Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), com uma moagem de cana da ordem de 633 milhões de toneladas por safra, o Brasil gera cerca de 70 milhões de toneladas de massa seca de palha. No entanto, pouco dos resíduos é aproveitado para a produção de etanol.

Murakami ressalta que praticamente todas as enzimas utilizadas no Brasil para a degradação de biomassa são importadas de um grupo restrito de empresas estrangeiras que detêm essa tecnologia sob segredo industrial. Com esse contexto, o coquetel enzimático importado pode representar até 50% do custo de produção do combustível.

“Existia um paradigma que o desenvolvimento de uma plataforma competitiva de produção de coquetel enzimático poderia levar décadas de estudos e que seria pouco provável de ser obtida apenas por técnicas de biologia sintética a partir de cepas públicas. Isso porque as empresas utilizaram diferentes métodos para desenvolver os coquetéis, como realizar evoluções adaptativas, expor o fungo a reagentes químicos e induzir mutações no genoma para então selecionar o fenótipo mais interessante. Porém, com a evolução de ferramentas de edição genética, como CRISPR/Cas9, conseguimos estabelecer em dois anos e meio uma plataforma competitiva apenas com poucas modificações racionais”, relata Murakami.

A partir do bioprocesso desenvolvido no CNPEM, foram produzidos 80 gramas por litro (g/L) de enzimas, ou a maior concentração já descrita em uma publicação científica a partir de fontes de carbono (açúcar) de baixo custo. O valor é mais que o dobro da mais alta concentração de enzimas até então relatada na literatura científica para esse tipo de fungo (37 g/L de enzimas).

“Um aspecto interessante desse trabalho é que ele não ficou preso apenas ao laboratório. Testamos a produção e o bioprocesso de escalonamento em uma planta-piloto, em ambiente semi-industrial, para avaliação da viabilidade econômica”, ressalta.

De acordo com Murakami, a despeito de a plataforma fúngica ter sido customizada para a produção de etanol celulósico a partir de resíduos da cana-de-açúcar, ela também é capaz de desconstruir outras biomassas e esses açúcares chamados de avançados poderiam ser utilizados para produção de outros biorrenováveis como plásticos e intermediários químicos.

Nova classe de enzimas

O trabalho é o resultado prático para aplicação na indústria de uma ampla investigação realizada pelo LNBR para a descoberta de enzimas capazes de degradar carboidratos. Em outro estudo, apoiado pela FAPESP e publicado na revista Nature Chemical Biology, os pesquisadores revelaram sete novas classes de enzimas presentes sobretudo em fungos e bactérias.

Segundo Murakami, a descoberta das novas enzimas tem grande potencial de aplicação não só na área de biocombustíveis, mas também em diferentes áreas da indústria, como a médica, alimentícia e têxtil, por exemplo. Isso porque essas moléculas podem servir de inspiração para novos processos industriais, pois demonstram diferentes maneiras com que a natureza decompõe polissacarídeos (carboidratos formados por açúcares simples).

Dessa forma, por ser capaz de degradar polissacarídeos beta-glucanos, a nova família de enzimas do tipo hidrólises glicosídicas (GH) tem amplo potencial de utilização, podendo atuar como conservantes alimentícios – por sua ação antifúngica ao quebrar a barreira que protege esses microrganismos –, ou ainda na indústria têxtil ou de biocombustíveis pela capacidade de digestão de matérias ricas em fibras vegetais.

“Realizamos um estudo baseado na diversidade da natureza em degradar polissacarídeos e em como podemos projetar a aplicação desse conhecimento em diferentes setores da indústria. Além da descoberta de novas enzimas, outro aspecto importante desse trabalho está na abordagem que utilizamos para sistematicamente conhecer a fundo essa nova família de enzimas a partir de redes de similaridades. Com isso, conseguimos em pouco tempo partir do ponto zero até chegar à família de enzimas mais estudadas que temos até agora ativas sobre beta-1,3-glucanos, com informações disponíveis sobre especificidade e mecanismos de ação”, afirma.

Isso porque, geralmente, estudos para classificar novas enzimas têm o critério evolutivo das moléculas (análise filogenética) como abordagem principal. No entanto, o trabalho do CNPEM teve como ponto de partida a funcionalidade das enzimas.

“Hoje com a evolução tecnológica de sequenciamento de DNA já temos um número grande de sequências genéticas conhecidas, além de capacidade bem estabelecida para estudar e caracterizar moléculas e enzimas a partir de suas funcionalidades. Com isso, aprimoramos uma abordagem chamada redes de similaridades que nunca tinha sido usada em enzimas ativas sobre polissacarídeos”, diz Murakami.

A abordagem de redes de similaridades permitiu classificar as enzimas pela funcionalidade, gerando sete subfamílias. Com isso, por meio da caracterização de pelo menos um membro representativo de cada subfamília foi possível acessar sistematicamente a diversidade de estratégias moleculares para a degradação de polissacarídeos beta-glucanos contida em milhares de membros da família de enzimas.

Tour de force bioquímico

Enquanto na análise filogenética a comparação tem como base as regiões conservadas da sequência de DNA – o que não foi alterado ao longo dos anos –, a classificação por funcionalidade se dá por meio da análise de regiões não conservadas e relacionadas com a diferenciação funcional. “Isso nos deu eficiência e permitiu agrupar mais de mil sequências em apenas sete subgrupos ou classes de mesma função.”

Por se tratar de uma nova abordagem, os pesquisadores realizaram uma série de outros estudos que serviram como contraprova para a validação do método de classificação. Dos sete grupos de enzimas capazes de degradar polissacarídeos, os pesquisadores obtiveram 24 estruturas inéditas, incluindo diversos complexos das enzimas com seus substratos, informações-chave para o entendimento dos mecanismos de ação.

O trabalho contou com uma parte de análise funcional e outra de estudo estrutural das moléculas para assim poder entender como a enzima está atuando nesse carboidrato. “Polissacarídeos podem adotar dezenas de configurações e fazer vários tipos de ligações químicas. E queríamos observar exatamente quais ligações químicas e arquiteturas eram reconhecidas por cada enzima. Portanto, foi necessário um estudo multidisciplinar, que combina dados estruturais e funcionais amparados em análises por espectrometria de massas, espectroscopia, mutagênese e experimentos de difração para elucidar a estrutura atômica”, diz.

Em texto da seção News & Views , publicado na revista Nature Chemical Biology, Paul Walton, pesquisador do Departamento de Química da Universidade de York (EUA), considerou o estudo um “tour de force bioquímico” não só pela abordagem inovadora, mas também pela rapidez com que os resultados foram obtidos. “O grupo de pesquisadores foi capaz de expressar e isolar exemplos de cada classe de enzimas para examinar se as diferenças em sequências genéticas se refletiram na forma estrutural e na funcionalidade”, diz Walton no comentário.

O artigo Rational engineering of the Trichoderma reesei RUT-C30 strain into an industrially relevant platform for cellulase production (doi: doi.org/10.1186/s13068-020-01732-w), de Lucas Miranda Fonseca, Lucas Salera Parreiras e Mario Tyago Murakami, pode ser lido em https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-020-01732-w.

O artigo Structural insights into β-1,3-glucan cleavage by a glycoside hydrolase family (doi: doi.org/1 0.1038/s41589-020-0554-5), de Camila R. Santos, Pedro A. C. R. Costa, Plínio S. Vieira, Sinkler E. T. Gonzalez, Thamy L. R. Correa, Evandro A. Lima, Fernanda Mandelli, Renan A. S. Pirolla, Mariane N. Domingues, Lucelia Cabral, Marcele P. Martins, Rosa L. Cordeiro, Atílio T. Junior, Beatriz P. Souza, Érica T. Prates, Fabio C. Gozzo, Gabriela F. Persinoti, Munir S. Skaf e Mario T. Murakami, pode ser lido em www.nature.com/articles/s41589-020-0554-5 .